細胞接着性材料およびその製造方法
【公開番号】特開平５－４９６８９
【発明の名称】細胞接着性材料およびその製造方法
【出願番号】特願平３－２５９５５０
【出願人】
【識別番号】０００００２１８５
【氏名又は名称】ソニー株式会社
【氏名又は名称】理化学研究所
【発明者】
【氏名】鈴木 嘉昭
【住所又は居所】東京都品川区北品川６丁目７番３５号 ソニー株式会社内
【氏名】日下部 正宏
【住所又は居所】東京都品川区北品川６丁目７番３５号 ソニー株式会社内
【要約】
【目的】 高分子材料表面の細胞接着性を向上させ、または新たに付与する。
【構成】 ポリスチレン（ＰＳ）製シャーレの底面にドース量１×１０15～３×１０17個／ｃｍ2 の範囲でＮ+ ，Ｎａ+ ，Ｎ2 + ，Ｏ2 + ，Ｋｒ+ 等のイオンを注入した後、ウシ胸部血管内皮細胞を培養した。いずれのイオンを用いた場合にも、イオン照射面２上ではイオン未照射面１上に比べて多くの細胞３が粘着していた。セグメント化ポリウレタン（ＳＰＵ）のフィルムを貼付したシャーレを用いた場合には、イオン未照射面上にはほとんど細胞が付着しないが、イオン照射面上において選択的に細胞が粘着した。赤外線吸収分光法、ラマン分光法により表面構造の変化を明らかにした。
【効果】 細胞培養用シャーレ，ハイブリッド型医療材料等として有望である。
【従来の技術】近年、皮膚，粘膜，血管，肝臓，脾臓等、人工材料のみでは機能の代替が不十分である臓器について、細胞組み込み型のハイブリッド人工臓器を目指す動きが活発化している。この場合、培養される細胞の足場となるマトリクスの材料を選択，設計することが重要な課題となる。たとえば、内皮細胞の付着，成長，分化が細胞の固定状態に依存することは良く知られている。マトリクスは一般に高分子材料から構成されているが、この高分子材料の表面を種々の手法で改質することが従来より行われている。
表面改質の方法は、プラズマ処理，放電処理等に代表される乾式処理と、コーティング，グラフト化等に代表される湿式処理とに大別される。たとえば、上記プラズマ処理としては、アルゴン等の不活性イオンのスパッタリング作用を利用する非反応性プラズマ処理や、酸素，水蒸気等の反応性ガスを用いた反応性プラズマ処理が行われている。いずれもイオン入射エネルギーは数ｋｅＶ程度であり、高分子材料の表面を粗面化して細胞の付着性や水に対する接触角を変化させたり、あるいは＞Ｃ＝Ｏ基や－Ｃ－Ｏ－結合等の極性構造部を導入して親水性を付与することができる。
またコーティングとしては、たとえばマトリクス表面に結合組織由来のコラーゲン，フィブロネクチン等の接着性タンパク質の溶液をプレコートし、内皮細胞，繊維芽細胞等の接着性を向上させることが行われている。
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の技術には解決すべき課題も残されている。まず、プラズマ処理を行うと高分子材料の表面が粗面化されるが、これは一般に細胞の付着を促進する反面、増殖を抑制する傾向がある。また、プラズマの状態は装置ごとに異なっているので、処理条件の統一化は実質的に不可能であり、制御性，再現性の向上を望むことはできない。
一方のコーティングには、細胞が接着性タンパク質の層を介してマトリクスに結合しているため、マトリクスと細胞間の接着力が比較的弱いという問題がある。そこで本発明は、細胞の接着性および増殖性に優れる細胞接着性材料、およびその制御性，再現性に優れる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の目的を達成するために鋭意検討を行った結果、細胞接着性材料の表面がイオン衝撃により改質された場合に顕著な接着性と増殖性の向上がみられること、および上記の改質を行うためには所定のドース量範囲内でイオン注入を行うことが有効であることを見出した。イオン注入による高分子材料の表面改質については、たとえばＭａｔ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｖｏｌ．１１０，ｐ．６６９（１９８９）、あるいは特開平３－１１２５６０号公報等において、シリコーン樹脂にＨ+ ，Ｏ2 + ，Ｎ2 + 等のイオン注入が施されてなる抗血栓性材料が開示されている。本発明では、このイオン注入技術を細胞接着性材料の表面改質に適用するわけである。
すなわち本願の第１の発明にかかる細胞接着性材料は、炭素を構成元素として含む高分子材料より構成され、表面の少なくとも一部がイオン衝撃により改質されてなることを特徴とする。
本願の第２の発明にかかる細胞接着性材料の製造方法は、炭素を構成元素として含む高分子材料の表面の少なくとも一部にドース量φが１×１０15≦φ＜１×１０18個／ｃｍ2 となる範囲でイオン注入を行うことを特徴とする。
本発明で使用される炭素を構成元素として有する高分子材料は、ポリスチレン，ポリウレタン等のように炭素系の主鎖を有するいわゆる有機高分子材料であっても、あるいはシロキサン（Ｓｉ－Ｏ－結合）を主鎖とし、側鎖に炭化水素基等を有するシリコーン樹脂等であっても良い。注入するイオン種としてはＨｅ+ ，Ｃ+ ，Ｎ+ ，Ｎｅ+ ，Ｎａ+ ，Ｎ2 + ，Ｏ2 + ，Ｋｒ+ 等が例示されるが、溶出して細胞の成育を阻害するものでなければこれらに特に限定されるものではない。
ドース量φは、１×１０15≦φ＜１×１０18個／ｃｍ2 の範囲に選ばれる。１０14個／ｃｍ2 のオーダーでは細胞接着性に顕著な改善効果がみられず、１０18個／ｃｍ2 のオーダーでは処理時間が大幅に延長するものの細胞接着性の改善効果は飽和する。イオン加速エネルギーに関しては、その高低によりエネルギー伝達機構に差異が生ずるものと考えられるが、実用的には数十～数百ｋｅＶ程度の範囲で設定すれば良い。
ビーム電流密度はおおよそ０．５μＡ／ｃｍ2 を越えない範囲に設定する。これは、ビーム電流密度が過大になるとターゲットである高分子材料の温度が上がり過ぎ、高分子材料自身が劣化する上、細胞の接着性が低下する虞れがあるからである。
[Structure]
Polystyrene (PS) Petri dishes were prepared, and the bottom surface was subjected to ion implantation using ions such as N+N^+, Na+Na^+, N2+N_2^+, O2+O_2^+, Kr+Kr^+ at a dose range of 1×10151 \times 10^{15} to 3×10173 \times 10^{17} ions/cm². Bovine thoracic endothelial cells were then cultured on these treated dishes. Regardless of the type of ion used, the number of cells adhering to the ion-irradiated surface (2) was significantly higher compared to the non-irradiated surface (1). When using a Petri dish coated with a segmented polyurethane (SPU) film, cells barely adhered to the non-irradiated surface, while selective adhesion was observed on the ion-irradiated surface. Infrared absorption spectroscopy and Raman spectroscopy revealed changes in the surface structure.
[Effect]
This technology holds promise for applications such as cell culture dishes and hybrid medical materials.
[Conventional Technology]
In recent years, efforts to develop hybrid artificial organs embedded with cells have been accelerating for organs like skin, mucous membranes, blood vessels, liver, and spleen, where the functionality of artificial materials alone is insufficient. In these cases, selecting and designing matrix materials that serve as scaffolds for cultured cells is a critical challenge. For instance, it is well-known that the adhesion, growth, and differentiation of endothelial cells depend on their fixed state. While matrices are generally composed of polymer materials, the surface of these polymer materials has traditionally been modified using various techniques.
Surface modification methods can be broadly categorized into dry processes, such as plasma treatment and discharge treatment, and wet processes, such as coating and grafting. For example, in plasma treatments, non-reactive plasma treatment utilizing the sputtering action of inert ions like argon and reactive plasma treatment using reactive gases like oxygen or water vapor are commonly employed. These treatments, with ion incident energies of several keV, can roughen the surface of polymer materials to enhance cell adhesion or alter the contact angle with water. Alternatively, they can introduce polar structural groups such as >C=O>C=O or −C−O−-C-O- bonds to impart hydrophilicity.
As for coatings, pre-coating matrix surfaces with adhesive proteins such as collagen or fibronectin derived from connective tissue has been practiced to enhance the adhesion of endothelial and fibroblast cells.
[Problems with Conventional Technology]
However, conventional technologies still have unresolved issues. Plasma treatments roughen the surface of polymer materials, which generally promotes cell adhesion but tends to suppress proliferation. Moreover, plasma conditions vary between devices, making it practically impossible to standardize treatment conditions and improve control and reproducibility.
On the other hand, coatings suffer from a relatively weak adhesion force between the matrix and cells, as the cells are attached to the matrix via a layer of adhesive proteins.
[Purpose of the Invention]
The present invention aims to provide cell-adhesive materials with superior cell adhesion and proliferation properties, as well as manufacturing methods with excellent controllability and reproducibility.
[Means to Solve the Problem]
After extensive research, the inventors discovered that significant improvements in adhesion and proliferation properties can be observed when the surface of cell-adhesive materials is modified through ion bombardment. Furthermore, performing ion implantation within a specific dose range was found to be effective in achieving these modifications.
Ion implantation-based surface modification of polymer materials has been disclosed, for example, in Mater. Res. Soc. Symp., Vol. 110, p. 669 (1989) and Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 3-112560, where H+H^+, O2+O_2^+, N2+N_2^+, etc., were implanted into silicone resins to create antithrombotic materials. This invention applies the same ion implantation technique to modify the surface of cell-adhesive materials.
Specifically, the first invention described herein pertains to a cell-adhesive material composed of a polymer material containing carbon as a constituent element, where at least part of the surface has been modified through ion bombardment.
The second invention relates to a method for manufacturing cell-adhesive materials, characterized by performing ion implantation on at least part of the surface of a polymer material containing carbon as a constituent element, within a dose range of 1×1015≤ϕ<1×10181 \times 10^{15} \leq \phi < 1 \times 10^{18} ions/cm².
The carbon-containing polymer materials usable in this invention include organic polymers with a carbon-based main chain, such as polystyrene and polyurethane, as well as silicone resins with a siloxane (Si−OSi-O) main chain and hydrocarbon groups or other functional groups as side chains.
The ion species that can be implanted include He+He^+, C+C^+, N+N^+, Ne+Ne^+, Na+Na^+, N2+N_2^+, O2+O_2^+, Kr+Kr^+, among others, provided they do not leach and inhibit cell growth.
The dose (ϕ\phi) is selected within the range of 1×1015≤ϕ<1×10181 \times 10^{15} \leq \phi < 1 \times 10^{18} ions/cm². At doses on the order of 101410^{14} ions/cm², significant improvements in cell adhesion are not observed, while doses on the order of 101810^{18} ions/cm² lead to prolonged processing times with diminishing returns in adhesion improvement.
The ion acceleration energy can be practically set in the range of several tens to several hundreds of keV, depending on the energy transfer mechanisms.
The beam current density should not exceed approximately 0.5 μA/cm20.5 \, \mu \mathrm{A}/\mathrm{cm}^2. Excessive beam current density can cause the target polymer material to overheat, resulting in material degradation and reduced cell adhesion.
※The ion species and the number of implanted ions seem to significantly affect the characteristics. This technology could be applicable to stents, but for widespread adoption, a simpler device and method will be necessary.
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